Tóxicos e inhibidores

La magnitud de toxicidad observada o recogida en la bibliografía es una función de diversos factores, incluyendo concentración, antagonismos, sinergismos, formación de complejos y aclimatación (Kugelman y Chin, 1971). La concentración es el único factor que usualmente se considera, lo que lleva a afirmaciones absolutistas, muchas veces erróneas.
En general la velocidad de crecimiento bacteriano aumenta con la concentración de substrato, llegando a un punto en que se estabiliza y, dependiendo de cada caso concreto, puede llegar a descender (inhibición por el substrato). Así, en términos absolutos, una substancia es un tóxico o un substrato dependiendo de su concentración. Los fenómenos de antagonismo y sinergismo son muy importantes al hablar de toxicidad. Antagonismo es una reducción de la toxicidad de un substrato en presencia de otro y sinergismo es el aumento del efecto tóxico de una substancia causada por la presencia de otra. La formación de complejos resulta, también, fundamental. Si una sustancia no está en solución, no puede penetrar dentro de la célula, y por tanto no podrá afectar el metabolismo del organismo. La magnitud del efecto tóxico de una substancia puede ser reducido significativamente por aclimatación de la población de microorganismos al tóxico. La aclimatación implica una reorganización de los recursos metabólicos para vencer los obstáculos metabólicos producidos por el substrato tóxico, más que mutación o selección de las poblaciones (Kugelman y Chin, 1971).
Otros factores pueden afectar también la toxicidad de un determinado compuesto, por ejemplo, el tipo de agregados bacterianos, siendo más resistentes, en general,  los lodos granulares que los floculentos (Hwu et al., 1997). También la temperatura juega un importante papel en el efecto tóxico de determinados compuestos (amonio, sulfuro, ácidos grasos volátiles, etc.).
Son muchas las substancias que pueden resultar inhibidoras del crecimiento de los microorganismos anaerobios. A continuación se describe brevemente los compuestos que más comúnmente presentan problemas de toxicidad, en los substratos utilizados en el presente trabajo.

Nitrógeno amoniacal
Los residuos ganaderos contienen altas concentraciones de compuestos nitrogenadas, función del sistema de alimentación, de la composición de los piensos, del tipo de animales de los que procede, así como del tipo de granja. El nitrógeno orgánico durante el proceso anaerobio se hidroliza produciendo formas amoniacales. Aunque el nitrógeno amoniacal es un importante nutriente para el crecimiento de los microorganismos (Bryant et al., 1971), cuya carencia puede provocar el fracaso en la producción de gas, una concentración excesivamente alta del mismo puede limitar su crecimiento.
Hay una gran dispersión en la bibliografía sobre la concentración de amonio inhibidora del proceso anaerobio. Así, a 50ºC una concentración de 1,7 g N-NH4+/L resultó inhibitoria para la digestión anaerobia de estiércol bovino (Zeeman et al., 1985). Hashimoto (1986), en reactores sin aclimatar, encontró signos de inhibición a una concentración de nitrógeno amoniacal de 2,5 g N-NH4+/L, tanto en mesofílico como termofílico, aunque al trabajar con reactores adaptados previamente la concentración inicial de inhibición fue de 4 g N-NH4+/L en el rango termofílico. Koster y Lettinga  (1988) consiguieron que el proceso se desarrollara a concentraciones de amonio extremadamente altas, hasta 12 g N-NH4+/L con un lodo granular, aunque a partir de 2,5 g N-NH4+/L se observó una disminución en la tasa específica máxima de crecimiento de los microorganismos metanogénicos, destacando la reversibilidad de la toxicidad por amonio, así como que la alta concentración de amonio apenas afecta la acidogénesis. Robbins et al. (1989) a niveles de 2,8 g N-NH4+/L no observaron inhibición, al menos de manera permanente, siendo el cultivo capaz de recuperarse al poco tiempo. Angelidaki y Ahring (1993) concluyeron que aunque es posible mantener un proceso estable con concentraciones de amonio por encima de 6 g N-NH4+/L en el rango termofílico, a partir  de esta concentración el volumen de gas producido es afectado seriamente. Krylova et al. (1997) trabajando con gallinaza encontraron que una concentración de amonio superior a 2,8 g N-NH4+/L suponía un descenso en el biogás producido de entre el 50 y 90% y del metano entre el 80 y el 90%. Hansen et al. (1998) obtuvieron un proceso de producción de biogás estable  con purines de cerdo a una concentración de amonio de 6 g N-NH4+/L, pero los índices de producción de biogás fueron menores que el potencial y además disminuyeron de forma importante al aumentar la temperatura y por tanto al aumentar el amonio libre. Flotats et al. (1999) observaron el efecto inhibidor del amonio sobre la producción de gas, a partir de una concentración de 2,1 g N-NH4+/L en el rango termofílico. La carga orgánica del reactor, y por tanto el número de microorganismos activos, parece afectar la inhibición por amonio (Ahring, 1995), lo que puede explicar en parte la variabilidad encontrada.
Van Velsen (1979) demostró que la adaptación del lodo metanogénico hace viable la digestión anaerobia en régimen mesofílico a concentraciones de 3 g N-NH4+/L para purines de cerdo y hasta 5 g N-NH4+/L  para lodos de depuradora. A pesar de la adaptación observada, la velocidad específica máxima de crecimiento desciende al aumentar la concentración de nitrógeno amoniacal. El efecto de adaptación de los microorganismos ha sido constatado por diversos autores (Hashimoto, 1986; Koster, 1986; Angelidaki y Ahring, 1993b; 1994; Hansen et al., 1998; Gallert et al., 1998).
La forma que parece causar la inhibición por amonio es el amoníaco libre (NH3) ya que el efecto inhibitorio del amonio parece aumentar a pH alcalinos y a altas temperaturas (Zeeman et al., 1985). Los límites de inhibición de nuevo varían mucho según el autor. Hashimoto (1986) encontró inhibición a una concentración de 0,02 g N-NH3/L en el rango mesofílico, 0,2 g N-NH3/L en el rango termofílico, sin aclimatación y 0,39 g N-NH3/L en el rango termofílico con aclimatación. Angelidaki y Ahring (1993b) observaron que con una concentración de 0,650 g N-NH3/L la velocidad de crecimiento de los metanogénicos a partir de acético disminuye un 20%. Hansen et al. (1998), trabajando con purines de cerdo, observaron inhibición sólo a partir de la concentración 1,1 g N-NH3/L, disminuyendo acusadamente la tasa de crecimiento específico. Este valor de la concentración de inhibición tan alto se debe a la larga adaptación previa del inóculo utilizado.
Los principales microorganismos afectados por altas concentraciones de amonio son los metanogénicos. Un cambio brusco en la concentración de amonio produce un descenso en la velocidad de crecimiento de los organismos metanogénicos, pero no en la tasa de crecimiento de los acidogénicos o acetogénicos (Koster y Lettinga, 1988; Robbins et al., 1989). Los microorganismos metanogénicos que consumen acético son más sensibles a la inhibición por amonio que los consumidores de H2 (Angelidaki y Ahring, 1993b, Hansen et al., 1998). La función de inhibición que relaciona la tasa específica de crecimiento con la concentración de amoníaco libre es función del tipo de microorganismos, siguiendo para los metanogénicos acetoclásticos un modelo sigmoidal, mientras que los que consumen H2 siguen un modelo lineal (Angelidaki et al., 1993). La consecuencia del modelo sigmoidal es que en un rango relativamente estrecho de concentraciones de amoníaco libre la velocidad de crecimiento desciende bruscamente, manteniéndose, sin embargo, más estable a concentraciones más altas.
Una concentración de amonio superior a los 7-8 g N-NH4+/L puede inhibir la hidrólisis de proteínas (Krylova et al., 1997). Gallert et al. (1998) observaron que al aumentar la concentración de 0,5 a 6,5 g N-NH4+/L en el régimen mesofílico aumentó la inhibición sobre la desaminación de peptonas (proteolisis) y la metanogénesis, y sin embargo no observaron acumulación de hidrógeno, indicando que la metanogénesis hidrogenotrófica no resulta inhibida a este nivel de concentración.
Algunos autores han apuntado diferencias de comportamiento frente a la inhibición por amonio de microorganismos mesofílicos o termofílicos. Aunque normalmente se considera más problemático el proceso termofílico, puesto que el agente inhibidor es el amoníaco libre, Gallert et al. (1998) encontraron que los microorganismos mesofílicos son más sensibles a la inhibición por NH3, con un valor de la constante de inhibición (considerando inhibición no competitiva reversible) de los metanogénicos, de 92 mg NH3/L, mientras que en termofílico el valor de esta constante se cifró 251 mg NH3/L; también encontraron que la degradabilidad de las proteínas (peptona) es mayor en termofílico que en mesofílico.

Ácidos grasos volátiles
Los ácidos grasos volátiles son los más importantes intermediarios del proceso anaerobio, siendo, por ello, fundamental conocer su evolución. Juegan un papel muy importante en la monitorización y control de reactores anaerobios, mostrando una rápida respuesta a las variaciones en el sistema, por ejemplo en el caso de sobrecargas orgánicas (Ahring et al., 1995), o en el caso de la introducción de tóxicos. El aumento de su concentración está relacionado con la disminución en la producción de biogás (Hill et al., 1987).
Además, los ácidos grasos volátiles pueden inhibir algunos de los procesos que tienen lugar en un reactor anaerobio, aunque hay cierta dispersión en la bibliografía.
La acumulación de propiónico en el reactor, especialmente de la forma no ionizada, puede inhibir la acetogénesis a partir de propiónico (Fukuzaki et al., 1990), y la metanogénesis acetoclástica (Barredo y Evison, 1991).
La acumulación de acético, puede inhibir la acetogénesis a partir de propiónico (Fukuzaki et al., 1990), y la acetogénesis a partir de butírico (Ahring y Westermann, 1988). Sin embargo, son necesarias concentraciones de acético muy altas para que llegue a afectar a la producción de metano, por encima de 4000 mg/L o más  (Stafford, 1982; Ahring et al., 1995).
Ahring et al. (1995) concluyeron que concentraciones de ácidos grasos volátiles por debajo de 50 mM, equivalente a 3000 mg acético/L, no producen ninguna disminución de la producción de metano. Son los ácidos propiónico y valérico los primeros que afectan al proceso, mientras que el butírico y el acético han de acumularse por encima de 100 mM para afectar a la tasa de producción de metano.

Hidrógeno
El hidrógeno es un importante intermediario del proceso anaerobio, tal y como se vio en el apartado 1.5.4, y su acumulación puede provocar la inhibición de la acetogénesis, con la consiguiente acumulación de ácidos grasos volátiles, estando especialmente descrita la acumulación de propiónico (Harper y Pohland, 1986; Boone y Xun, 1987; Fukuzaki et al, 1990). Hill y Cobb (1993) relacionaron altos valores de la presión parcial de H2 con el aumento de la fracción iso sobre la fracción n de los ácidos butírico y valérico.

Compuestos azufrados en los sistemas anaerobios
En presencia de sulfatos las bacterias metanogénicas compiten con las bacterias sulfato-reductoras por los substratos útiles, mostrando las últimas, ventajas termodinámicas y cinéticas sobre las primeras, tanto sobre las que consumen hidrógeno como sobre las acetoclásticas (Hulshoff Pol et al., 1998). El resultado de esta competición determinará la proporción de sulfhídrico y metano en el biogás producido. El sulfato es, además, un importante inhibidor, aumentando el efecto inhibidor en función de la relación DQO/sulfato, de forma que los substratos adaptados no muestran inhibición para valores de la relación por encima de 10, y sí hay signos de inhibición por debajo de un valor de 7-8, aunque es posible mantener un proceso estable (Omil et al., 1995).
Además de la competición, el sulfíhidrico es tóxico a altas concentraciones para muchos grupos bacterianos. Parece que la forma tóxica es la no ionizada, ya que es la que puede atravesar la membrana celular, por lo que la inhibición se ve favorecida a pH bajos y a bajas temperaturas (predominio de la forma no ionizada y mayor solubilidad en la fase líquida). En general el lodo granular es menos sensible que la biomasa en suspensión a la inhibición por H2S a pH bajos y neutros, aunque parece ser similar a altos pH. A pH altos la inhibición de las metanogénicas es mayor que la de las sulfato-reductoras, mientras que a bajos pH no hay diferencia entre ambos grupos. En general, los metanogénicos son más sensibles que los acetogénicos y los acidogénicos. A pH de 7,5 a 9, la inhibición de las sulfato-reductoras acetoclásticas se determina por la concentración de sulfuros totales, más que por la concentración de H2S. Además del pH, la relación DQO/sulfato influye en la sensibilidad de un lodo, debido a las diferentes asociaciones bacterianas, así como la temperatura  (Hulshoff Pol et al., 1998). A altas temperaturas se favorece el paso de H2S del líquido al gas al disminuir la solubilidad de éste, por lo que, en principio, habrá menos problemas en el rango termofílico. Los niveles de concentración de H2S a los cuales se produce la inhibición al 50% varían en función de los citados parámetros, pero están entre 50 y 250 mg/L. Sin embargo, concentraciones más bajas, 23 mg S/L en el rango termofílico, pueden producir inhibición del proceso metanogénico si se digiere un material con alto contenido en nitrógeno amoniacal, por ejemplo purín de  cerdo (Hansen et al., 1999).

Ácidos grasos de cadena larga
Altas concentraciones de ácidos grasos de cadena larga pueden inhibir el proceso de digestión anaerobia (Galbraith et al., 1971; Hanaki et al., 1981; Angelidaki et al., 1990; Angelidaki y Ahring, 1992; Rinzema et al., 1994; Hwu et al., 1997). Las grasas neutras (triglicéridos) son hidrolizadas rápidamente a ácidos grasos de cadena larga (AGCL). Las concentraciones límite de inhibición no están muy claras en la bibliografía y depende mucho del tipo de ácido graso, así como de la forma en que se encuentra. El efecto inhibidor de los ácidos grasos de cadena larga provoca un aumento de la duración de la fase lag en ensayos en discontinuo (Hanaki et al., 1981).
Aunque la adsorción de los AGCL sobre la pared celular puede jugar un papel importante sobre la inhibición, ésta se ha relacionado con la concentración de AGCL, más que con la relación de ácidos grasos/biomasa (Koster y Cramer, 1987; Angeldaki y Ahring, 1992). El efecto tóxico se ha descrito como no reversible, y la forma tóxica son los ácidos grasos libres. El efecto inhibidor de los lípidos está muy relacionado con la adaptación de los microorganismos, y prácticamente condicionados a la existencia de microorganismos acetogénicos que degraden AGCL a medida que se van produciendo por hidrólisis de las grasas (triglicéridos u otras formas), evitando así, alcanzar concentraciones tóxicas (Angeldaki y Ahring,1992, Rinzema et al., 1994).
Según la bibliografía, la toxicidad de los ácidos grasos de cadena larga, en especial del oleico, es mayor en el rango termofílico que en el mesofílico, estando también afectada por el tipo de lodo (granular o floculento) (Hwu et al., 1997). Angeldaki y Ahring concluyeron que los ácidos grasos libres de cadena larga, oleico y estérico, inhiben todos los pasos de la digestión anaerobia termofílica, provocando, a una concentración de 0,2 g/L de oleico, el aumento en la duración del desfase inicia en la producción de metano, fase lag, mientras que el crecimiento bacteriano es completamente inhibido a una concentración de 0,5 g/L de oleico y 1,0 de esteárico (Angeldaki y Ahring, 1992).
En presencia de calcio el efecto tóxico de los ácidos grasos de cadena larga disminuye debido a la precipitación de las sales cálcicas (Galbraith et al., 1971; Koster, 1987; Angelidaki et al., 1990).

Cationes y metales pesados
Todos los cationes pueden proporcionar toxicidad a algún nivel de concentración, aumentando la toxicidad con el peso molecular, por lo que los metales pesados son los que provocan toxicidad a menor concentración, (Hayes y Theis, 1978).
El orden de toxicidad de los metales pesados es Ni > Cu >> Cr(IV) ? Cr(III) > Pb > Zn (Hayes y Theis, 1978). Los niveles de inhibición varían mucho en función de la fuente, debido a varios factores. En primer lugar la toxicidad es menor si la introducción en el reactor es gradual (Tabla 1). Los metales pesados precipitan en presencia de sulfuros, desapareciendo de la solución, por lo que resultan menos tóxicos para los microorganismos, pudiendo llegar a tolerarse elevadas concentraciones de metales pesados (Kugelman y Chin, 1971).
Otros cationes como calcio, sodio, potasio, etc., pueden resultar inhibidores para el proceso anaerobio, a concentraciones altas (Kugelman y Chin, 1971; Omil et al., 1995; Kim et al., 1999). La concentración de inhibición por cationes depende mucho de la presencia de posibles antagonistas, tal y como se muestra en la Tabla 2. El potasio es antagonista del sodio, del magnesio y del calcio; el sodio lo es del amonio, potasio, magnesio y calcio; el calcio del potasio; el magnesio del potasio y el amonio del potasio (Kugelman y Chin, 1971).

Desinfectantes y antibióticos
Los antibióticos son comúnmente añadidos a las dietas de los animales, para mejorar la producción o para control de enfermedades. La presencia de penicilina y tetraciclina, procedentes de la dieta de los animales, en el purín de cerdo, tiene un efecto inhibitorio sobre el proceso, aunque parece haber una buena aclimatación a la presencia de dichas substancias (Massé et al., 2000). Hilpert et al. (1987) encontraron que dos antibióticos, monensin y lasalocid, usados normalmente en las dietas inhiben el proceso anaerobio, aunque el segundo precisa una concentración muy alta. Sin embargo otros muchos antibióticos no han mostrado ningún efecto sobre el proceso, como flavomicin y bacitracin (Hilpert et al., 1987) y tylosin, lyncomycin, sulphamethazine y carbadox (Massé et al., 2000).
Los restos de desinfectantes, procedentes de la limpieza y desinfección de las granjas en los residuos animales pueden resultar tóxicos para el sistema anaerobio (Hilpert et al., 1987). La toxicidad dependerá, básicamente de la concentración, de la biodegradabilidad de los mismos, y del tiempo transcurrido desde su utilización, hasta la entrada del residuo en el sistema anaerobio.
Los residuos de cultivos agrícolas, susceptibles de ser utilizados para producción de metano, pueden contener algunos compuestos tóxicos para el crecimiento de los microorganismos anaerobios, por ejemplo, residuos de pesticidas, compuestos fenólicos, terpenos, resinas, etc. Al realizar un pretratamiento químico con ataque ácido o básico, se pueden formar, también, compuestos tóxicos (Speece, 1987b).