Etapa fermentativa o acidogénica

Las moléculas orgánicas solubles son fermentadas por varios organismos fermentativos formando compuestos que pueden ser utilizados directamente por las bacterias metanogénicas (acético, fórmico, H2) y compuestos orgánicos más reducidos (láctico, etanol, propiónico, butírico, principalmente) que tienen que ser oxidados por bacterias acetogénicas a substratos que puedan utilizar las metanogénicas (Stams, 1994). Las proporciones entre los productos de la fermentación varían en función del consumo de H2 por parte de las bacterias que utilizan hidrógeno. Cuando el H2 es eliminado de forma eficiente las bacterias fermentativas no producen compuestos reducidos como el etanol, favoreciendo la producción de H2  y la liberación de energía en forma de ATP (Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991). La actividad de algunas bacterias fermentativas y acetogénicas depende de la concentración de H2, siendo posible sólo a valores muy bajos de presión parcial de H2. La eliminación continua de H2 mediante oxidación por CO2 (bacterias metanogénicas hidrogenotróficas) estimula la acción de las bacterias fermentativas, al eliminar un producto de la reacción (Boone y Xun, 1987).

Fermentación de carbohidratos solubles.
La ruta de degradación de la glucosa en los sistemas anaerobios proporciona como principales productos ácidos grasos volátiles, H2 y CO2. La estequiometría que se propone para este proceso varía en función de la fuente consultada. Así, McCarty (1971), como posteriormente recogió Pavlostathis y Giraldo-Gómez (1991), propone una estequiometría basada en principios bioenergéticos y termodinámicos, considerando la energía producida en la respiración y la consumida para la síntesis celular de los microorganismos responsables. Siguiendo a Pavlostathis y Giraldo-Gómez (1991), las fracciones de glucosa consumida para la respiración y para la síntesis son, respectivamente, 0.504 y 0.496. ?Gº=-50.39 kcal/mol de glucosa,

La principal ruta metabólica de degradación de glucosa para formar ácidos orgánicos es la de Embden-Meyerhof (Figura 1), que tiene como principal intermediario el piruvato  (Mosey, 1983).
La fermentación de azúcares se realiza por diversos tipos de microorganismos, siguiendo diferentes rutas metabólicas, en función del organismo responsable, y obteniendo productos finales diferentes. Los principales microorganismos son los que producen butírico o butanol, básicamente del género Clostridium, que convierten la glucosa y algunos aminoácidos en ácido butírico, acético, CO2 y H2. La glucosa se convierte en piruvato mediante la ruta Embden-Meyerhof, y el piruvato se desdobla a Acetil-CoA y CO2 (Madigan et al., 1998). El Acetil-CoA se reduce en los productos de fermentación empleando como transportador de electrones el NADH derivado de las reacciones glucolíticas de la ruta Embden-Meyerhof (Metzler, 1981). Las proporciones de los diversos productos se modifican por la duración y las condiciones de la fermentación, siendo el butírico y el acético los productos mayoritarios si el pH se mantiene alcalino (Madigan et al., 1998).

Figura 1.  Simplificación de las rutas metabólicas de degradación de la glucosa por las bacterias acidogénicas (Mosey, 1993).

Las bacterias ácido-propiónicas, del género Propionibacterium,  llevan a cabo un proceso distinto, conocido como fermentación acido-propiónica, en el que se produce la fermentación del ácido láctico, carbohidratos y polihidroxialcoholes, produciendo, principalmente, ácido propiónico, succínico, acético y CO2. Sus requerimientos nutricionales son complejos y crecen con lentitud. Las diferencias en el metabolismo respecto a los Clostridium se producen a partir de la formación del piruvato por la ruta Embden.-Meyerhof. La base de la fermentación ácido-propiónica es la conversión del piruvato a oxalacetato por carboxilación y la conversión ulterior, a través de succinato y succinil-CoA a metilmalonil-CoA y propionil-CoA. Con objeto de que la oxidación-reducción resulte equilibrada dos tercios de la glucosa se transforman en propionato y un tercio en acetato (Metzler, 1981).

Fermentación de aminoácidos
Los principales productos de la fermentación de aminoácidos y de otras moléculas nitrogenadas son ácidos grasos de cadena corta, succínico, aminovalérico y H2 (Tabla 3). La fermentación de aminoácidos se considera un proceso rápido y que en general, no limita la velocidad de la degradación de compuestos proteicos (Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991). La estequiometría varía mucho en función de la fuente consultada, siendo además diferente para cada aminoácido. La estequiometría propuesta por McCarty, 1974, y adaptada por Pavalostathis et al. (1991), considerando las diferentes fracciones para respiración y síntesis de biomasa, se expresa como sigue,
Algunos organismos del  género Clostridium pueden fermentar aminoácidos. Los productos finales de la oxidación son NH3, CO2 y un ácido carboxílico con un átomo de carbono menos que el aminoácido oxidado (Madigan et al., 1998). Producen n-butírico y ácido isobutírico, isovalérico, caproico, sulfuro de hidrógeno, metilmercaptano, cadaverina, putrescina (en función del tipo de aminoácido de que proceda), etc.

Cinética de la fermentación de hidratos de carbono y aminoácidos
La mayoría de los modelos publicados simulan la velocidad de la fermentación mediante la cinética de Monod (2.9), modificada por funciones de inhibición, aunque muchos autores no consideran inhibición, debido a la versatilidad de los microorganismos fermentativos.
La tasa específica máxima de crecimiento de los microorganismos que degradan carbohidratos varía de 0,50 a 0,20 h-1, y la constante de saturación (Ks) de 0,004 a 11,76 mM (Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991). En la  Tabla 2 se muestran una colección de parámetros cinéticos adaptada de Pavlostathis y Giraldo-Gómez (1991).
Inhibidores de la fermentación de hidratos de carbono y aminoácidos.
No se han descrito muchos inhibidores de esta etapa, destacándose tan sólo los ácidos grasos de cadena larga (AGCL), señalados por Angelidaki et al. (1999). La concentración de hidrógeno juega un papel regulador importante del funcionamiento de la fermentación, tal y como describen Boone y Xun (1987).

Oxidación anaerobia de ácidos grasos de cadena larga (Acetogénesis de AGCL).
La ruta principal de degradación de AGCL es la B-oxidación. Los ácidos grasos libres son introducidos en la célula a través de la pared celular. Este proceso puede ser desarrollado por un gran número de microorganismos, incluso un número mayor que los organismos capaces de hidrolizar las grasas.
Una vez dentro de la célula, el ácido graso es convertido en el correspondiente tio-ester-CoA, lo que sirve tanto para activar su degradación, como para disminuir el efecto tóxico de los ácidos grasos libres. La B-oxidación es un ciclo en espiral que va liberando un acetil-CoA en cada bucle, produciendo, principalmente, ácido acético. Si se trata de un ácido con un número, n, impar de átomos de carbono, al final se obtendrían n-1 acetil-CoA y un propionil-CoA (Ratledge, 1992).  Durante el proceso se produce la deshidrogenación del ácido graso, liberándose hidrógeno molecular a través del intermediario NADH. El H2 es el principal aceptor de electrones.
La B-oxidación de AGCL es una reacción endotérmica, lo que unido a la linealidad de la ruta metabólica, hace que el proceso sea muy dependiente de la acción simbiótica de los microorganismos consumidores de hidrógeno para que se pueda producir. A modo de ejemplo la degradación de un ácido graso de cadena larga (palmítico, de 16 átomos de carbono), sería de la siguiente forma (Hanaki et al., 1981):


Tabla 2. Resumen de parámetros cinéticos para las diferentes fases y diferentes grupos en el proceso de digestión anaerobia (adaptado de Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991).
Según Pavlostathis y Giraldo-Gómez (1991), considerando la síntesis celular, y considerando de forma inseparable la metanogénesis a partir de hidrógeno, la ecuación estequiométrica, queda (Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991):

Cinética de la oxidación anaerobia de ácidos grasos de cadena larga.
Pocos autores han introducido la degradación de ácidos grasos de cadena larga en sus modelos, y los que lo han hecho han utilizado la cinética tipo Monod modificada por factores de inhibición (Siegrist et al., 1993). Angelidaki et al. (1999) consideran dos términos multiplicativos (uno referente a la limitación de AGCL y otro referente a la concentración de amonio, nutriente necesario para la síntesis celular), teniendo en cuenta también un factor multiplicativo en función del pH. La inhibición por el substrato la simulan mediante cinética de Haldane.

 Inhibición de la oxidación anaerobia de ácidos grasos de cadena larga.
El principal inhibidor de este proceso es el H2 (Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991; Stam, 1994). Siegrist et al. (1993) señalan también como inhibidor de este proceso la concentración de ácido acético. Angelidaki et al. (1999) consideran como principal inhibidor la propia concentración de AGCL, junto con el pH.