El diagnóstico indirecto
El diagnóstico indirecto es independiente del
conocimiento previo de la naturaleza molecular de la
mutación a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo es
preciso conocer la localización cromosómica del
locus implicado. Dicha estrategia consiste en estudiar, en la
familia del propositus, la segregación conjunta de la
enfermedad y secuencias polimórficas físicamente
próximas (ligadas) al locus de la misma.
El ADN es una molécula lineal en la que las secuencias
de nucleótidos se hallan contiguas y distribuidas a lo
largo de la doble hélice en un mundo de una
dimensión. Existe pues una relación física de
proximidad entre secuencias de ADN. Dicha relación de
continuidad puede alterarse durante el proceso de la
división meiótica que se presenta durante la
formación de las células germinales. En la profase
de la primera división meiótica, los cromosomas
homólogos (uno proveniente de la línea paterna y el
otro de la línea materna) intercambian material por el
proceso de entrecruzamiento. El resultado final es tal que los
cromosomas de la célula germinal madura (espermatozoide u
óvulo) presentan nuevas combinaciones de las secuencias
existentes en la célula original (nuevos recombinantes).
Dada la relación física existente entre secuencias
adyacentes en un mismo cromosoma, la frecuencia en que dos de
estas secuencias se transmitan (segregan) independientemente de
una generación a la siguiente es directamente proporcional
a la distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es la
distancia que separa a dos secuencias de ADN, menos probable es el
entrecruzamiento entre ellas y por lo tanto segregarn
independientemente con una menor frecuencia. Cuando se da esta
situación decimos que ambas secuencias están
ligadas.
El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el
estudio de la segregación de los alelos de dichas
secuencias en genealogías. Este tipo de estudios permiten
la obtención del mapa genético de una determinada
región cromosómica. Dicho mapa contendrá
puntos de referencia al estilo de un mapa de carreteras.
Así, mientras que el mapa de carreteras nos informa de la
posición de pueblos y ciudades, el mapa genético
contendrá información sobre la posición de
los genes. Además de pueblos y ciudades el mapa de
carreteras contiene otros puntos de referencia orientativos como
pueden ser un cruce de carreteras, un puerto de montaña o
una vista panorámica. Dichos puntos de referencia son
fundamentales para orientarse a lo largo de la carretera. Su
equivalente en el mapa genético serán por ejemplo
los puntos de rotura de una determinada translocación o las
secuencias polimórficas repartidas a lo largo de la
molécula de ADN..
Secuencias polimórficas
Como su nombre indica, las secuencias polimórficas
(también conocidas como secuencias anónimas, loci
anónimos, loci polimórficos, marcadores
anónimos o marcadores polimórficos) son secuencias
de ADN que, normalmente, no codifican para un producto
génico, se distribuyen de forma más o menos
aleatoria a lo largo del genoma y presentan como
característica singular el hecho de ser
polimórficas. Este último hecho es de suma
importancia pues confiere a este tipo de secuencias la
característica primordial del análisis
genético, la variabilidad.
Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya
hemos utilizado este concepto anteriormente al hablar de los
alelos de loci implicados en enfermedades (el alelo _508 de la
fibrosis quística o el alelo _S de la anemia falciforme).
Sin embargo, este tipo de alelos son, afortunadamente, muy poco
frecuentes y no nos serían útiles en los estudios de
ligamiento. Por el contrario las secuencias anónimas o loci
polimórficos presentan por definición varios alelos
con una frecuencia significativamente alta en la población
(superior al 1% para el menos frecuente).
Supongamos que queremos saber si el locus a, que está
implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b,
que es una secuencia anónima de ADN. Lo primero que
necesitaremos será identificar las variantes de la
secuencia anónima en cada uno de los miembros de la familia
y estudiar su segregación juntamente con la de la
enfermedad. La aplicación de diversos métodos
estadísticos nos permitirá establecer la existencia
o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la
distancia que los separa.
En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos
loci se mide en función de la frecuencia en que ambos
recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM) . Si dos
loci recombinan en el 1% de las meiosis, decimos que les separa
una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinación entre
dos loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci
están íntimamente ligados) hasta el 50% y decimos
entonces que son independientes. Aunque no nos podemos extender
aquí sobre este aspecto, no existe siempre una
relación lineal entre distancia genética (frecuencia
de recombinación medida en cM) y distancia física
(número de nucleótidos que las separan, medida en
pares de bases). Para frecuencias de recombinación
inferiores al 20% se puede establecer una relación de 106
pares de bases por cada 1% de recombinación.
Tipos de variación polimórfica en secuencias
anónimas
Hemos indicado que la característica primordial de las
secuencias anónimas es su variabilidad, veamos ahora en que
consiste dicha variabilidad. Básicamente existen dos tipos
de polimorfismos, los que derivan de la substitución de un
nucleótido por otro y los que derivan de la
inserción o deleción de secuencias de ADN. En estos
últimos distinguimos dos subtipos: las inserciones o
deleciones de fragmentos de ADN y las repeticiones de secuencias
de entre dos y cientos de nucleótidos.
Polimorfismos del tamaño de los fragmentos de
restricción (RFLP del inglés "restriction
fragment length polymorphism").- Cuando el cambio de un
nucleótido altera la diana para un determinado ER o la
inserción o deleción de un fragmento de ADN se
localiza entre dos dianas de un ER, podemos detectar el
polimorfismo en función de la variación que
éste genera en el patrón de restricción
(Figura 17 ). Los RFLP son polimorfismos que presentan normalmente
un número bajo de alelos y por lo tanto su
utilización en el diagnóstico indirecto es
limitada.
Figura 17 .-
Polimorfismos del tamaño de fragmentos de
restricción (RFLP). La pérdida o ganancia de una
diana de restricción por efecto de la
substitución de un nucleótido (A), o la
inserción o deleción de un fragmento de ADN (B),
pueden ser detectados por las variaciones en los tamaños
de los fragmentos de restricción. En la figura se
presenta el resultado esperado de este tipo de polimorfismos en
individuos homozigotos para la presencia de la diana o la
deleción (+ +), los homozigotos para la ausencia de
diana o la inserción (- -) y los heterozigotos (+ -). El
método de detección puede ser tanto
hibridación y southern (esquematizado en la figura) como
mediante PCR.
Polimorfismos de repetición.- Existen dos tipos
de polimorfismos de repetición de uso en diagnóstico
genético, los VNTR-minisatélites y los
VNTR-microsatélites. En ambos casos presentan un
número variable de repeticiones en tandem (VNTR del
inglés "variable number of tandem repeats").
Los minisatélites son loci que corresponden a secuencias
de ADN de unas pocas decenas de nucleótidos repetidas en
tandem. El número de dichas repeticiones varia de cromosoma
a cromosoma, de forma que en un cromosoma el número de
repeticiones en tandem puede ser de 10, en otro de 15 en otro de
22, etc, etc. La singularidad más especial de este tipo de
polimorfismos está en que cada loci puede presentar muchos
alelos distintos (tantos como repeticiones), sin embargo presentan
el inconveniente que no están distribuidos por todo el
genoma y por lo tanto solo pueden ser utilizados en el diagnostico
de un número muy reducido de enfermedades. Los
VNTR-minisatélites han encontrado su máxima
aplicación en la determinación de la paternidad y en
los protocolos de identificación genética en el
ámbito judicial. Cuando se habla de huellas dactilares del
ADN se está hablando de este tipo de polimorfismo.
Figura 18.-
Detección mediante PCR de distintos alelos de un
polimorfismo microsatélite. En el ejemplo se presentan
dos individuos heterozigotos para los alelos de 6 y 7
repeticiones y de 4 y 8 repeticiones del dinucleótido
(CA)n. La detección se realiza mediante PCR utilizando
como cebadores oligonucleótidos que flanquean a la
región que contiene la repetición (flechas). De
cada individuo se amplifican fragmentos de ADN que difieren
entre si por el número de repeticiones. El resultado de
la amplificación se fracciona en un gel de
acrilamida-urea para determinar el genotipo de cada
individuo.
Los VNTR-microsatélites son por excelencia los
polimorfismos anónimos utilizados en el diagnóstico
genético. Corresponden a la repetición en tandem de
secuencias de entre 2 y 5 nucleótidos. Los
microsatélites presentan dos características que los
hacen ideales para su uso. En primer lugar, están
distribuidos de forma casi homogénea por todo el genoma y
en segundo lugar, presentan un número elevado de alelos con
frecuencias similares entre sí, de forma que la
probabilidad de que un individuo sea heterozigoto es muy elevada
(presentan una alta heterozigosidad). Su detección se
realiza normalmente mediante la técnica de PCR (Figura
17).
Aplicación en el diagnóstico indirecto de
enfermedades hereditarias
El ejemplo más sencillo de aplicación de los
polimorfismos anónimos en el diagnóstico indirecto
lo tenemos en el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X.
Veamos el ejemplo de la Figura 19. En la familia en
cuestión ha nacido un varón afectado de una
enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X. De acuerdo con el
patrón de herencia, su padre presentará el alelo
normal de la enfermedad, mientras que su madre será
portadora, es decir heterozigota. El varón afectado
habrá heredado de su madre el cromosoma con el alelo de la
enfermedad y dada su condición de hemizigoto,
manifestará el fenotipo correspondiente a la misma. Sin
embargo no podemos predecir, más allá del modelo
mendeliano, el genotipo de la hermana ni el del feto que se
está desarrollando.
Supongamos que existe un locus polimórfico, tipo
microsatélite, próximo al locus de la enfermedad,
íntimamente ligado (frecuencia de recombinación
igual a 0). Si identificamos los alelos de dicho polimorfismo en
cada uno de los miembros de la familia podremos inferir el alelo
del locus de la enfermedad que porta cada individuo.
En la parte inferior de la figura se presenta, de forma
simplificada, el resultado obtenido al caracterizar mediante PCR
el locus polimórfico. En el margen izquierdo se presenta un
patrón correspondiente al número de repeticiones del
dinucleótido CA (de 1 a 6) y perpendicularmente a cada
individuo el alelo correspondiente a cada uno de ellos. Podemos
ver que el varón afectado ha heredado de su madre el alelo
de 2 repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho alelo
está junto al alelo de la enfermedad. Según ello, la
hermana habrá heredado de su padre el alelo 4 del
polimorfismo junto con el alelo normal de la enfermedad y de su
madre el alelo 6 que también en este caso irá junto
al alelo normal. Por lo tanto la hermana será homozigota
para el alelo normal de la enfermedad. Siguiendo un razonamiento
similar podemos inferir que el feto será una niña
(presenta dos alelos del polimorfismo) y heterozigota para la
enfermedad, pues ha heredado de su madre el alelo 2 del
polimorfismo que como hemos indicado anteriormente está
acompañado por el alelo que causa la enfermedad. La Figura
20 es una interpretación de lo anteriormente indicado.
Figura 19.-
Genealogía de una familia en la que se hereda una
enfermedad ligada al cromosoma X. Véase el texto.
En el ejemplo anterior hemos utilizado como marcador del locus
de la enfermedad a un locus altamente polimórfico, los
cromosomas paternos presentan alelos distintos y por lo tanto los
podemos identificar sin ambigüedad alguna, y
íntimamente ligado, es decir no existe recombinación
entre ambos loci y por lo tanto el alelo del polimorfismo que en
la madre va junto al alelo de la enfermedad continuará
junto a éste en los cromosomas de la descendencia. Estas
dos características son fundamentales en el momento de
escoger un determinado polimorfismo en el desarrollo de una
estrategia de diagnóstico indirecto.
Figura 20.-
Representación gráfica del razonamiento
aplicado para determinar los genotipos de los miembros de la
familia de la Figura 19. Los varones presentan dos
cromosomas distintos (un cromosoma X y un cromosoma Y). La
estrella vacía indica el alelo normal y la estrella
llena el alelo de la enfermedad. Cada alelo del locus del
polimorfismo está indicado de acuerdo con el
número de repeticiones del dinucleótido
CA.
Si el marcador utilizado no presenta muchos alelos entonces
pueden darse situaciones de ambigüedad cuando uno o ambos
padres sean homozigotos para un determinado alelo del marcador. En
este caso diremos que la familia es "no informativa" para dicho
marcador y por lo tanto deberemos utilizar otro polimorfismo en el
diagnóstico de dicha familia. Por otra parte, si el
marcador no esta íntimamente ligado, es decir existe
recombinación entre el locus de la enfermedad y el locus
del marcador, el diagnóstico deberá tener en cuenta
dicha posibilidad.
Veamos el siguiente ejemplo. En la Figura 21 se presenta la
genealogía correspondiente a una familia en la que se
hereda una enfermedad con una herencia autosómica
dominante. Con una probabilidad del 50% la madre afectada
transmitirá a sus descendientes el carácter. La
utilización de un locus polimórfico ligado al
carácter en cuestión nos permitirá establecer
un diagnóstico más ajustado para el feto en
desarrollo. En la Figura 21, A se muestra el resultado obtenido al
analizar un polimorfismo microsatélite (repetición
del dinucleótido CA). Vemos que la madre presenta los
alelos 6 y 2 y el padre los alelos 4 y 7. Por su parte el hijo
normal es portador de los alelos 2 y 7, el primero procedente de
la madre y el segundo del padre. Si el carácter es
penetrante, podemos considerar que el alelo 2 en la madre
está junto al alelo normal del locus de la enfermedad. Por
lo tanto, si el feto presenta el alelo 2 del polimorfismo podremos
inferir que también ha heredado el alelo normal del otro
locus.
Sin embargo, tal y como se presenta en la Figura 21, B, si la
distancia que separa a ambos loci es tal que permite la
recombinación entre ellos, es posible que el feto haya
heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo junto con el
alelo de la enfermedad, debido a la recombinación de ambos
loci en la meiosis de la madre. La frecuencia con la que se
presentará este segundo caso será la frecuencia de
recombinación entre los loci implicados. Así, si la
distancia que les separa es de 5 cM, es decir su frecuencia de
recombinación es del 5%, el diagnóstico que daremos
en el caso presentado en la Figura 21 será de un 95% de
probabilidad de que el feto sea normal (apartado A) y de un 5% de
que el feto haya heredado el alelo de la enfermedad junto con el
alelo 2 del polimorfismo (apartado B).
Figura 21.- Diagnóstico
indirecto de una enfermedad autosómica dominante. En A
el locus del polimorfismo y el de la enfermedad no presentan
recombinación. En B, el feto en desarrollo presenta un
cromosoma materno en el cual se ha dado un evento de
recombinación (flecha) durante la meiosis de la madre.
La simbología es la misma que la utilizada en la Figura
20.
Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnóstico se
utilizan varios loci polimórficos localizados a ambos lados
del locus de la enfermedad. Con ello se consiguen evitar las
ambigüedades generadas por el entrecruzamiento.
La dimensión social del diagnóstico
genético
Si bien este aspecto será tratado con una mayor
extensión y detalle en otros capítulos del libro, no
quisiera finalizar este capítulo sin abordar algunos de los
aspectos ético-sociales que acompañan al diagnostico
genético. En la introducción se enumeraron algunas
de las características diferenciadoras de este tipo de
diagnóstico respecto al diagnóstico convencional.
Las diferencias no son de índole metodológica o
tecnológica, dado que en los distintos ámbitos de la
biomedicina la complejidad tecnológica es similar, sino que
estas radican en el ámbito de sus implicaciones
ético-sociales. Desearía destacar algunos de los
aspectos más significativos de esta dimensión
ético-social.
El primero se refiere a la relación que se establece
entre el paciente y su familia. Todo diagnóstico genera en
el paciente una tensión que se resuelve en un sentido
positivo o negativo según sea el resultado. El
diagnóstico genético no solo genera tensión
en el propositus sino que toda su familia se ve implicada en
él. Esta implicación no es solo de índole
solidaria, la tensión en la familia obedece a una
reacción primaria al verse directamente implicados en la
patología como potencialmente afectados. Es por ello que el
genetista debe considerar a la familia como la unidad de
diagnóstico y aliviar mediante la adecuada
información, la angustia y la tensión que el
diagnóstico pueda generar.
El segundo aspecto hace referencia a la componente predictiva
del diagnóstico genético. Sin duda alguna la
fatalidad que acompaña al diagnostico positivo de una
enfermedad hereditaria no tiene parangón en otras
disciplinas médicas. Ello es así, porque en la
actualidad la mayoría de las enfermedades hereditarias
carecen de una terapia curativa. Cuando en una familia se
diagnóstica un hijo con fibrosis quística no solo se
esta dando una predicción sobre la progresión
clínica del paciente en un futuro próximo, sino que
además se esta asignando a la familia una predicción
sobre futuros embarazos. Así mismo, cuando uno de los
miembros de una familia es diagnosticado como afecto de una
enfermedad hereditaria de manifestación tardía, los
miembros jóvenes de la familia reciben una carga de
angustia y tensión. Un ejemplo de esta situación lo
tenemos en el diagnóstico de la enfermedad de Huntington.
¿Querrán los miembros de la familia saber cual es el
diagnóstico del propositus? ¿Desearán los
familiares asintomáticos ser sometidos a un
diagnóstico? Estas y otras cuestiones se podrán
plantear y la respuesta no es obvia.
La determinación de los factores de riesgo y el estudio
de la predisposición o susceptibilidad genética es
uno de los campos de futura aplicación del diagnostico
genético. Sin duda alguna esto comportará grandes
beneficios medico-sociales, al facilitar la medicina preventiva en
enfermedades como la diabetes, la hipertensión, las
enfermedades cardiovasculares u otras de carácter
multifactorial, que tienen una gran prevalencia en nuestra
población. Sin embargo, todo lo positivo que comporta este
tipo de estudios puede verse truncado por una mala
utilización de la información obtenida.
No se debe asignar rango de infalibilidad a una
información de tipo probabilístico. La probabilidad
de padecer la enfermedad de Alzheimer se incrementa en un factor
de 8 en los individuos homozigotos para el alelo APO-_4, pero ello
no implica que un individuo homozigoto para dichos alelos vaya a
manifestar inexorablemente la enfermedad. Los factores
ambientales, la historia natural de cada individuo, y el fondo
genético tienen un papel muy importante en la
manifestación fenotípica de un carácter.
Resulta curioso constatar que en la actualidad los más
acérrimos defensores del papel del ambiente en la
ecuación: fenotipo = genotipo + ambiente, sean los
genetistas.
BIBLIOGRAFÍA
- Elles R (1996). Molecular Diagnosis of Genetic Diseases.
Humana Press, New Jersey
-
- Landegren U, (1996). Laboratory Protocols for Mutation
Detection. Oxford University Press. Oxford.
-
- Korf B. R. (1996). Human Genetics. A problem-Based
Approach. Blackwell Science. Cambridge, Massachusetts
-
- Strachan T, Read AP (1996). Human Molecular Genetics. BIOS
Scientific Publishers Ltd. Oxford.
-
- Dracopoli NC, et al. (1994). Current Protocols in Human
Genetics. John Whiley & Sons, Inc. New York.
-
- Andrews LB, et al. (1994). Assessing Genetic Risks:
Implications for Health and Social Policy. National Academy
Press.
-
- Davies KE (1993). Human Genetic Disease Analysis : A
Practical Approach (Practical Approach Series) Irl Press.
-
- Watson JD, Witkowski J, Gilman M, Zoller M. (1992).
Recombinant DNA. 2nd Ed. Freeman & Co., New York.
-
- Bernstam V. (1992). Handbook of Gene Level Diagnostics in
Clinical Practice. CRC
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