El diagnóstico directo

El máximo nivel de precisión del diagnóstico directo se obtiene con la secuenciación de los nucleótidos correspondientes al locus mutado, sin embargo la aplicación de esta estrategia diagnóstica de forma generalizada es por el momento inviable.

Por lo general el diagnóstico directo de una mutación se realiza mediante el estudio de los cambios que ésta produce en la estructura primaria (secuencia), en las propiedades fisico-químicas de la molécula de ADN o bien en los cambios que se presentan en el producto génico (sea este ARN mensajero o proteína).

Básicamente podemos distinguir cuatro tipos de cambios o mutaciones del ADN:

  1. cambios de nucleótidos. Una base es substituida por otra distinta. Existen dos tipos de cambios, las transversiones (una purina (A o G) por una pirimidina (C o T)) y las transiciones (una pirimidina por una pirimidina o una purina por una purina),
  2. pequeñas deleciones o inserciones. Un número reducido de nucleótidos se pierden o insertan, alterando la secuencia y tamaño de la molécula de ADN,
  3. grandes reorganizaciones. Ganancias, pérdidas o reorganizaciones de grandes fragmentos de ADN y
  4. mutaciones dinámicas. Repetición inestable de trinucleótidos en distintas regiones de un gen.

Los cambios de nucleótidos y las pequeñas deleciones o inserciones alteran la estructura primaria del ADN y pueden dar lugar a variaciones del tamaño de la molécula o bien, como veremos más adelante, pérdidas o ganancias de dianas de restricción. Así mismo la molécula mutada puede presentar variaciones en sus propiedades fisico-químicas que alteren su movilidad electroforética o sus propiedades de apareamiento complementario. Las grandes reorganizaciones y las mutaciones dinámicas provocan generalmente variaciones en el tamaño de la molécula de ADN. Finalmente, las mutaciones pueden ser detectadas en el producto génico cuando estas dan lugar a mensajeros inestables o de tamaño distinto o bien a proteínas truncadas.

Herramientas y metodologías para la detección de mutaciones

Las técnicas y protocolos utilizados en el diagnóstico molecular se circunscriben en el ámbito de la biología molecular básica. No estamos hablando de una tecnología excesivamente compleja y de hecho cualquier laboratorio de biología molecular está capacitado técnicamente para llevar a cabo este tipo de análisis.

Básicamente las técnicas comunes a todos los laboratorios de diagnóstico molecular son:

  1. los enzimas de restricción,
  2. las técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos,
  3. la hibridación de ácidos nucleicos y
  4. la amplificación enzimática del ADN (PCR)

Brevemente discutiremos cada una de esta técnicas.

Los enzimas de restricción (ER). Los ER son proteínas que reconocen secuencias concretas del ADN, denominadas dianas de restricción y tienen actividad endonucleasas (cortan la doble hélice del ADN). Existen distintos tipos de ER según sea el tipo de secuencia reconocida y el lugar de corte. Las que tienen una aplicación más generalizada en el diagnóstico molecular son las de tipo II, que reconocen secuencias palindrómicas de entre 4 y 8 nucleótidos (secuencias que se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda) y cortan el ADN en dicha secuencia (Figura 7).

Figura 7. Los enzimas de restricción (ER). En la figura se presenta la actividad endonucleasa de los ER Taq I (obtenida de la bacteria termófila Thermus aquaticus) y EcoR V (obtenida de la enterobacteria Escherichia coli). Ambos enzimas tienen especificidad para la secuencia reconocida (diana) y cortan a la misma liberando fragmentos con extremos cohesivos o romos respectivamente.ste tipo de enzimas tiene una total especificidad por la secuencia diana y el cambio de un solo nucleótido en está produce la pérdida de reconocimiento. Las mutaciones debidas a variaciones nucleotídicas o las pequeñas deleciones o inserciones pueden producir la pérdida de una diana o la aparición de una nueva diana donde antes del cambio ésta no existía.

Separación electroforética de ácidos nucleicos. El método más común y eficaz de fraccionar moléculas de ADN en función de su tamaño es la electroforesis en soporte de agarosa o acrilamida. En ambos casos las moléculas de ADN (o ARN) se aplican a una matriz semisólida, generalmente un polímero de agarosa o acrilamida, que actúa como cedazo restringiendo el paso de las moléculas en función de su tamaño. La electroforesis se realiza en un tampón a pH básico de forma que las moléculas de ADN están cargadas negativamente. Para inducir el desplazamiento a través de la matriz se aplica un campo eléctrico y las moléculas se desplazan hacia el polo positivo. Dado que la carga neta de cada molécula es la misma, sea cual sea su tamaño, el único parámetro discriminatorio es el tamaño del poro de la matriz utilizada. El resultado final es la separación de las moléculas de ADN en función de su tamaño. Las moléculas más pequeñas pasarán más fácilmente a través del poro mientras que las grandes quedarán retenidas (Figura 8).

Figura 8. Separación electroforética de ácidos nucleicos. La muestra se aplica próxima al polo negativo y migra hacia el polo positivo. Los fragmentos grandes de ADN quedan retenidos en su migración al pasar con mayor dificultad a través del poro. Los fragmentos más pequeños alcanzan el extremo final del gel, pasando con facilidad a través de los poros

Hibridación y transferencia de ácidos nucleicos. Una de las características más singulares de la molécula de ADN es la complementariedad de bases. La doble hélice de ADN está formada por dos cadenas antiparalelas en las que las bases nitrogenadas están apareadas de forma que una adenina (A) está siempre frente a una timina (T) y una citosina (C) está siempre frente a una guanina(G). La unión entre las bases se establece mediante puentes de hidrógeno, dos en el par AT y tres en el par GC que confieren a la doble hélice una alta estabilidad. Experimentalmente podemos separar las dos cadenas, proceso que denominamos desnaturalización, aplicando energía en forma de calor, rompiendo los enlaces químicamente o disminuyendo la concentración salina (Figura 9). Modificando estos parámetros en sentido opuesto podremos renaturalizar dos moléculas de cadena sencilla y obtener una cadena doble. El proceso de renaturalización dependerá fundamentalmente de la complementariedad de bases que presenten las dos cadenas sencillas.

La identificación de secuencias de ADN mediante la técnica de hibridación consiste en obtener un fragmento de ADN (sonda) de secuencia complementaria a la región a identificar y marcarla enzimática o radioactivamente.

Figura 9. Hibridación de ácidos nucleicos. Procesos de desnaturalización y renaturalización. Véase el texto para explicación.

La hibridación de ambas moléculas, sonda y secuencia a detectar, puede realizarse en solución o bien con una de ellas fijada a un soporte sólido. En éste último caso el soporte suele ser un filtro de nitrocelulosa o nylon. Las moléculas de ácidos nucleicos se absorben pasivamente al filtro y posteriormente son fijadas mediante luz ultravioleta.

Los fragmentos de ADN separados en un gel de agarosa o acrilamida, pueden ser transferidos y fijados a un filtro de nitrocelulosa o nylon para ser detectados mediante una sonda. El sistema de transferencia, conocido como método Southern, permite obtener en el filtro una réplica exacta del gel.

Amplificación enzimática de ADN. La amplificación enzimática del ADN consiste en la obtención de copias de una secuencia específica de ADN mediante una reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR). Dicha metodología ha supuesto una auténtica revolución en el campo de la biología y genética molecular y su aplicación en el diagnóstico genético es en la actualidad imprescindible.

Las ADN polimerasas son los enzimas que llevan a cabo la replicación del ADN. Para ello precisan de una molécula de ADN de cadena sencilla que actúe como molde, un cebador (pequeña molécula de ácido nucléico de unos 15 a 20 nucleótidos) de secuencia complementaria a la cadena a sintetizar y nucleótidos activados para ser incorporados en la cadena naciente.

Figura 10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase texto para explicación.

Para amplificar cíclicamente una determinada secuencia de ADN deberemos disponer de cebadores (también denominados oligonucleótidos) que flanqueen los extremos de la región que deseamos amplificar (ver Figura 10). Incrementando la temperatura por encima de los 90 ºC obtendremos cadenas sencillas de ADN que actuarán como molde en la reacción de amplificación. Para favorecer el apareamiento del cebador con su secuencia complementaria bajaremos la temperatura hasta un valor preestablecido y específico para cada oligonucleótido, a la cual el cebador se apareará con su secuencia complementaria. Utilizando como anclaje al cebador apareado, la ADN polimerasa iniciará la extensión de la cadena. El ciclo se iniciará de nuevo con la desnaturalización por calor de la molécula recién sintetizada. La repetición de este proceso entre 20 o 30 veces nos permitirá obtener millones de copias de la secuencia inicial.

El enzima utilizado para esta reacción es una ADN polimerasa resistente a temperaturas elevadas obtenida de bacterias termófilas (Thermus aquaticus).

Métodos de detección directa de mutaciones

Veremos a continuación mediante algunos ejemplos como se aplican estas técnicas básicas en el diagnóstico genético.

Detección directa de una mutación que altera una diana de restricción. La anemia falciforme es una enfermedad autosómica recesiva con una alta prevalencia en determinadas regiones geográficas. Los pacientes afectados por esta patología presentan en homozigosis la substitución de una glutamina por una valina en el tercer aminoácido de la _-globina (_S). Dicha mutación se corresponde con el cambio de una adenina por una timina en el codón 6 de dicho gen que al mismo tiempo altera la diana de restricción para el enzima MstII.

Aprovechando esta circunstancia se ha diseñado un método muy sencillo para detectar la mutación. Como se indica en la Figura 11, la secuencia normal del gen de la _ -globina en los codones 5, 6 y 7 (cct gag gag) incluye la diana para el enzima Mst II (cctgagg). Dicha diana se pierde con la mutación que causa anemia falciforme al pasar a ser (cctgtgg). Flanqueando a esta diana existen dos dianas para el mismo enzima: una a 1,2 kb y otra a 0,2 kb de distancia. La digestión del ADN genómico de un individuo con el enzima Mst II, dará lugar a miles de fragmentos entre los cuales estarán los correspondientes al locus de la _ -globina. Podemos ahora separar todos los fragmentos según su tamaño en un gel de agarosa y transferir el resultado a un filtro de nitrocelulosa. Utilizando una sonda complementaria al fragmento de 1,2 kb, podremos detectar aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria a la sonda (véase parte inferior de la Figura 11).

Figura 11. Detección de la mutación que causa anemia falciforme mediante digestión con el enzima Mst II. Véase texto para explicación.

Si un individuo es homozigoto para el alelo normal de la _ -globina, el único fragmento que será detectado por la sonda será el de 1,2 kb. Si el individuo es portador del alelo de anemia falciforme detectaremos dos fragmentos: el de 1,2 kb y el de 1,4 kb, uno proveniente del cromosoma que tiene la secuencia normal (con diana) y el otro proveniente del cromosoma con la secuencia de la anemia falciforme (sin diana). Finalmente, en un individuo homozigoto para la anemia falciforme solo detectaremos el fragmento de 1,4 kb.

Figura 12. Detección de la mutación de anemia falciforme mediante PCR y digestión con el enzima Mst II. Véase texto para explicación.

Una variación del método anterior se presenta en la Figura 12. La aplicación de la técnica de PCR facilita enormemente la detección de mutaciones en las que varia una diana de restricción. El método consiste en obtener oligonucleótidos que flanqueen la mutación y mediante PCR obtener millones de copias de dicha región. Seguidamente los fragmentos amplificados se ponen en presencia del enzima en cuestión, en nuestro caso Mst II. Si el ADN proviene de un individuo normal todos los fragmentos amplificados presentarán la diana para el enzima y por lo tanto después de la digestión obtendremos dos subfragmentos (en el ejemplo del fragmento amplificado de 300 pb se obtendrán dos subfragmentos: uno de 200 y otro de 100 pb). Si el ADN proviene de un individuo afectado todos los fragmentos amplificados tendrán la secuencia que no es reconocida por el enzima y por lo tanto la digestión no alterará su tamaño (todos continuarán siendo de 300 pb). Finalmente, si el ADN proviene de un individuo heterozigoto los fragmentos amplificados serán de dos clases, con la secuencia diana o sin dicha secuencia. La digestión de los primeros dará lugar a dos fragmentos de 200 y 100 pb, mientras que los segundos mantendrán el tamaño de 300 pb después de la digestión. La resolución en un gel de agarosa de cada una de estas muestras se presenta en la parte inferior de la Figura 12.

Detección directa de la secuencia mutada.- Cuando la mutación ha sido caracterizada y se conoce su base molecular es posible diseñar estrategias diagnósticas basadas en la detección de la secuencia mutada. Se han descrito distintos métodos de detección directa, de entre los cuales comentaremos la detección mediante oligonucleótidos específicos de alelo (ASO, del inglés "alelle specific oligonucleotides"). Un ejemplo de este método lo tenemos en la Figura 13 donde se presenta la detección de mutaciones en el gen de la fibrosis quística.

Figura 13. Detección de mutaciones en el gen de la fibrosis quística mediante oligonucleótidos específicos de alelo. Véase texto. ( -> cebadores).

La fibrosis quística (CF) es una grave enfermedad hereditaria con una alta incidencia en la población caucasiana. En esta enfermedad las funciones de pulmones y páncreas están alteradas por un aumento en las secreciones de dichos órganos. Los pacientes afectados manifiestan los síntomas propios de la CF, alteraciones en las vías respiratorias e infecciones recurrentes, durante el primer año de vida viéndose muy afectada su calidad y esperanza de vida. Se han descrito numerosas mutaciones del locus CF, siendo la más frecuente la deleción de tres nucleótidos (CTT) que supone la pérdida del aminoácido 508 de la proteína CFTR (mutación _508). Según el área geográfica un 65-70% de los alelos mutados corresponden a _508. El 30% restante corresponde a alelos con una frecuencia no superior al 3%. La problemática derivada de la existencia de un gran número de mutaciones para un determinado locus (heterogeneidad alélica) es común a muchas enfermedades hereditarias. En estos casos puede resultar más apropiado el diagnóstico indirecto mediante polimorfismos anónimos (ver más adelante). Sin embargo, en el caso de la CF, dada su alta incidencia y la prevalencia de la mutación _508 se han puesto a punto métodos de detección directa como el ASO.

El método consiste en el diseño de oligonucleótidos con la secuencia correspondiente a cada uno de los alelos descritos para CF, incluyendo como control a la secuencia normal. Cada mutación puede estar localizada en una región distinta del gen. En la Figura 13 se presentan 5 mutaciones situadas en cinco exones distintos. De cada mutación se dispone de la secuencia y de cebadores que permiten amplificar el exón correspondiente. Después de obtener ADN de cada uno de los pacientes, mediante los cebadores apropiados se realiza una PCR para cada exón. Esta reacción se realiza en un solo tubo de forma que se obtiene una mezcla de todos los exones amplificados. La muestra así obtenida se aplica por duplicado a un filtro de nylon y el ADN se fija mediante luz UV. Seguidamente el filtro se hibrida con el ASO correspondiente a cada mutación y a su control normal, marcados previamente de forma enzimática, con fluorescencia o radioactividad. Después del revelado apropiado obtendremos una señal positiva que nos revelará los alelos presentes en cada paciente. En el ejemplo de la Figura 13, el paciente 1 es heterozigoto para la mutación _508, pues da positivo para el ASO del alelo normal de todas las mutaciones y también para el ASO del alelo _508. El paciente 2 es homozigoto para la mutación _508, pues en el filtro de dicha mutación solo obtenemos señal positiva para el ASO del alelo _508. Los pacientes 3, 4 y 5 son heterozigotos compuestos para las mutaciones _508 - W1282X , _508 - R177H y _508 - R553X respectivamente. Finalmente el paciente 6 es también heterozigoto en este caso para la mutación N1302K. Más allá del interés académico por conocer que mutación está presente en un paciente, el interés del diagnóstico específico del alelo o alelos mutados reside en la relación existente entre dicho alelo y la manifestación clínica de la enfermedad. No son muchas las enfermedades en las cuales se ha podido establecer este tipo de correlación, pero en el caso de la CF se ha podido demostrar que los pacientes homozigotos para la mutación _508 presentan insuficiencia pancreática mientras que los heterozigotos compuestos R117H / _508 tienen una función pancreática normal.

Detección de mutaciones por deleción.- Las mutaciones que suponen una pérdida de nucleótidos en la secuencia de ADN son fácilmente detectadas mediante PCR. Un ejemplo de aplicación lo tenemos en la detección de mutaciones en el gen de la distrofia muscular de Duchenne (DMD).

Esta enfermedad presenta una herencia ligada al cromosoma X por lo que su frecuencia es muy superior en hombres que en mujeres. Se caracteriza por la pérdida progresiva del tono muscular que se manifiesta desde el primer año de vida. Los niños afectados de DMD tienen problemas para mantenerse derechos y correr. A edades más avanzadas la musculatura se debilita presentándose paradas cardíacas y parálisis. La esperanza de vida no supera los 25 años. Existe una manifestación más benigna conocida como distrofia muscular de Becker.

El diagnóstico de la enfermedad puede realizarse mediante la determinación de la actividad creatinin fosfoquinasa, muy elevada en los pacientes con DMD y por biopsia muscular para visualizar al microscopio la estructura degenerativa de las células musculares. Cuando se pretende un diagnóstico prenatal, no es posible aplicar la estrategia anterior y éste debe realizarse mediante el análisis del genotipo.

El gen DMD es el gen humano de mayor tamaño hasta ahora caracterizado. El locus DMD ocupa más de 2 megabases de ADN que dan lugar a un transcrito de 13 kb. La proteína denominada distrofina tiene un total de 3.685 aminoácidos y presenta una estructura repetitiva. El análisis molecular del gen DMD ha revelado que un número importante de mutaciones se producen por deleciones distribuidas a lo largo del locus, presentándose tanto pequeñas como grandes pérdidas de ADN (2/3 de los varones afectados presentan deleción). No se ha detectado ninguna correlación entre el tamaño de la deleción y su manifestación en forma de distrofia muscular de tipo Duchenne o de tipo Becker. Sin embargo, sí que existe una clara correlación entre la ausencia de distrofina y manifestación en la forma grave de distrofia muscular de Duchenne.

Así pues, las deleciones que causan una pérdida total del producto génico presentan una manifestación clínica mucho más grave (Duchenne) que aquellas que respetando la pauta de lectura, dan lugar a la síntesis de una proteína anómala (Becker).

La detección de distrofina en biopsia muscular, mediante la utilización de anticuerpos específicos, es una buena metodología diagnóstica. Sin embargo, su carácter invasivo y elevado coste económico hacen que sea substituida por el diagnóstico genético.

Figura 14. Multiplex PCR. Detección de mutaciones por deleción en el locus DMD. Utilizando los oligonucleótidos indicados en la parte superior de la figura se amplifican, en una sola reacción, distintos exones del gen DMD. Los primeros carriles corresponden a controles, un estándar de fragmentos amplificados, un control negativo de la PCR en el cual no se añade ADN y un control positivo de un individuo con el alelo normal. De 1 a 5 son varones afectados de DMD. El paciente 1 presenta una deleción de los exones b y c. El paciente 2 presenta una deleción desde el exón b al exón g. El paciente 3 presenta una deleción de toda la región analizada. El paciente 4 tiene delecionado el exón a y finalmente el paciente 5 ha perdido los exones d y e.

En la Figura 14 se presenta un esquema de la estrategia de "multiplex PCR" desarrollada para la detección simultánea de distintas deleciones en el gen DMD en varones afectados. Mediante la utilización de parejas de cebadores, previamente optimizados, se amplifican de forma simultánea distintos exones del gen DMD. El resultado de cada PCR múltiple se analiza en un gel de agarosa obteniéndose un patrón de bandas del cual es posible inferir las regiones delecionadas.

Una vez se han determinado cuales son los exones delecionados es posible definir en cada paciente los extremos de la deleción y estimar así el comportamiento clínico esperado de dicho paciente.

El método de PCR múltiple tiene una proporción muy baja de errores de diagnóstico, es muy versátil, rápido (en tan solo un día es posible analizar varios individuos) y barato. Así mismo, las cantidades de ADN necesarias para el análisis son muy reducidas por lo que su aplicación es posible tanto en el diagnóstico postnatal como en el prenatal.

Detección de mutaciones inestables.- A principios de los años 90 se identificó un nuevo tipo de mutación conocida como "mutación inestable", producida por la expansión de unidades de repetición de tres nucleótidos. En la actualidad, se han identificado más de 50 genes eucariotas que presentan este tipo de repeticiones, entre los cuales se encuentran genes humanos responsables de un número importante de patologías neurológicas (Tabla II). Este nuevo tipo de mutación presenta diversas características:

  1. la repetición es polimórfica y se presenta tanto en individuos sanos como en afectados, siendo el número de repeticiones como mínimo de entre 2 y 5 veces superior en los afectados que en los sanos.
  2. el número de repeticiones puede variar, expandirse o, en algunos casos contraerse de generación en generación. En algunas de las patologías implicadas se observa una progresión partiendo de un número de rango normal, pasando por una premutación de rango intermedio y finalmente una mutación completa.
  3. en varias de las patologías se encuentra una fuerte correlación entre el número de repeticiones y distintos parámetros clínicos como la edad de manifestación (fenómeno conocido como anticipación) o el tipo de presentación clínica (gravedad, órganos o tejidos afectados, etc.).
  4. todas las mutaciones inestables con carácter patológico identificadas hasta el momento, afectan de forma directa o indirecta al sistema nervioso o neuromuscular. La mayoría comparten el patrón de herencia dominante, salvo la ataxia de Friedriech que lo presenta recesivo. La repetición puede localizarse tanto en región codificante (exones) o no codificante (región 5', región 3' o intrones), por lo que sus efectos pueden ir desde alteraciones en la expresión del gen hasta la abolición del producto génico.

El diagnóstico molecular de este tipo de mutaciones tiene un alto interés dado que el tamaño de la repetición permite extrapolar una parte importante del comportamiento clínico del paciente. Durante los últimos años se han estandarizado diversos métodos de detección basados en las técnicas de Southern (hibridación y detección mediante una sonda) o PCR (Figura 15). En el primer caso (Figura 15, A), la detección se realiza mediante una sonda de ADN homóloga a una secuencia adyacente a la región repetida. Se obtiene ADN genómico del paciente y se digiere con un enzima de restricción con dianas que flanquean al locus inestable. Una vez digerido se fracciona en un gel de agarosa y éste se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. El filtro se hibrida con la sonda para detectar los fragmentos que contienen la región inestable. El tamaño de los fragmentos detectados es del orden de kilobases.

Tabla II. Patologías neurológicas causadas por mutaciones inestables

Herencia
Repetición
Región
Normal
Pre-mutación
Mutación

X Frágil

XD
CGG
5' nc
6-46
50-200
> 200

Distrofia Miotónica

AD
CTG
3' nc
5-40
50-80
> 100

Atrofia muscular espinal

XD
CAG
exón
17-26

40-52

Enfermedad de Huntington

AD
CAG
5' nc
13-35

36-120

Atrofia dentatorubral

AD
CAG
exón
7-23

49-75

Ataxia espinocerebelosa 1

AD
CAG
exón
19-37

39-63

Enfermedad de Machado-Joseph

AD
CAG
exón
13-16

68-79

Ataxia de Friedreich

AR
GAA
intrón
7-22

200-1200
nc no codificante, XD ligada al X dominante, AD autosómica dominante, AR autosómica recesiva

Para la aplicación de la técnica de PCR en el diagnóstico de las mutaciones inestables se utilizan cebadores que flanquean la región amplificada (figura 14, B). El producto de la amplificación, cuyo tamaño puede estar en el rango de unos cientos de pares de bases, se aplica a un gel de agarosa o acrilamida con el objeto de determinar el tamaño de cada fragmento. Tal y como se presenta en la figura es posible detectar los fragmentos amplificados de individuos normales o en aquellos que presentan premutación, sin embargo puede suceder que no se detecte el fragmento procedente de un individuo con la mutación completa. Esto es así debido a que la DNA polimerasa puede tener problemas al intentar amplificar los tamaños del orden de kilobases que se presentan en el cromosoma con la mutación completa.

Figura 15. Detección de mutaciones dinámicas mediante PCR o hibridación. Vese texto para explicación. N, normal; P, premutación; M, mutación.

En el esquema también puede observarse que las bandas amplificadas mediante PCR tienen una cierta heterogeneidad en su definición. Esto es así debido por una parte al polimorfismo en el número de repeticiones y por otra a los errores de la DNA polimerasa.

Detección de nuevas mutaciones.- Hasta el momento hemos presentado diversas estrategias diagnósticas para la detección de mutaciones previamente caracterizadas, sin embargo en la rutina diaria del laboratorio de diagnóstico genético se plantea con frecuencia la identificación de mutaciones que bien por ser desconocidas o bien por ser poco prevalentes, precisan de una aproximación diagnóstica diferente.

Probablemente éste es el ámbito del diagnóstico genético que más vinculación tiene con la investigación básica, confundiéndose en numerosas ocasiones una con la otra.

Las distintas estrategias de detección de nuevas mutaciones pueden ser agrupadas en tres grandes apartados:

  1. detección de variaciones en el apareamiento entre las cadenas "normal" y mutada.
  2. detección de cambios de conformación y
  3. detección de productos génicos alterados

En el primer grupo se incluyen dos métodos ampliamente utilizados como son el análisis de heteroduplex y la digestión química de cadenas con apareamientos erróneos (CCM, del inglés "chemical cleavage of mismatch"). En ambos métodos el cambio o mutación se detecta mediante la hibridación en solución de la cadena normal (N) y la cadena mutada (m) obtenidas previamente mediante PCR. Moléculas de ADN que corresponden a la secuencia de la cadena mutada (mm) se mezclan con moléculas de ADN que corresponden a la secuencia de la cadena normal (NN). Después de la desnaturalización por calor de ambas cadenas se permite su renaturalización. Si existe alguna diferencia en la secuencia de nucleótidos entre ambos tipos de cadenas, además de los híbridos NN y mm (homoduplex), también se formarán hídridos del tipo Nm (heteroduplex) que presentarán errores de apareamiento. En el método de heteroduplex los híbridos se analizan en un gel de acrilamida y las diferencias entre ellos se visualizan por la aparición de un patrón de bandas anómalo. En el método CCM los híbridos son tratados con un reactivo químico (por ejemplo tetróxido de osmio) que cortan a la doble cadena de ADN en regiones de apareamiento erróneo. La aparición de fragmentos de degradación será indicación de la existencia de una variación entre la cadena normal y la mutada.

De los métodos de análisis de cambios de conformación, destaca por su versatilidad, economía y aceptación generalizada el análisis de conformación de cadena sencilla (SSCP, del inglés "single-strand conformation polymorphism"). El método SSCP se fundamenta en los cambios de conformación que presentan dos cadenas sencillas de ADN que difieren entre sí en un único nucleótido. Dichos cambios de conformación se pueden poner de manifiesto en un gel de acrilamida por la aparición de un patrón de bandas diferencial. El método es muy resolutivo y su aplicación es técnicamente simple. Algunas de las limitaciones de la técnica son:

  1. las condiciones de la electroforesis (temperatura y concentración de aditivos como glicerol o sacarosa) deben ser determinadas empíricamente,
  2. el tamaño de la molécula a analizar no puede exceder los 300-350 pb y
  3. presenta una sensibilidad inferior al 100%

A pesar de estas limitaciones es una técnica ampliamente utilizada como primera aproximación al estudio y caracterización de nuevas mutaciones. Su aplicación en la detección rutinaria de nuevas mutaciones consiste básicamente en amplificar mediante PCR fragmentos de 200 pb del locus a estudiar. Los productos de amplificación se desnaturalizan por calor y se analizan en un gel de acrilamida juntamente con un control de secuencia normal. La aparición de un patrón de bandas anómalo es indicativo de un posible cambio nucleotídico. Dicho cambio será posteriormente confirmado mediante la secuenciación del fragmento cuyo patrón se ha visto alterado.

Figura 16. Detección de variantes polimórficas mediante PCR y polimorfismo de cadena sencilla (SSCP). Véase texto para explicación.

La simplicidad del método permite también su aplicación en la detección de variantes polimórficas del tipo RFLP. En la Figura 16 se presenta un ejemplo de la aplicación de la técnica de SSCP en la detección de una variación polimórfica del extremo 3' del locus del receptor de la vitamina D. Dicho polimorfismo altera la diana de restricción del enzima Bsm I al cambiar la secuencia ACATTC (alelo B) por GCATTC (alelo b). Mediante oligonucleótidos sintéticos que flanquean el locus polimórfico se obtienen fragmentos de ADN de 192 pb. Los productos de amplificación se desnaturalizan para obtener cadenas sencillas de ADN y estas se resuelven a temperatura ambiente en un gel de acrilamida. El patrón de bandas obtenido será distinto en función del genotipo del paciente. Si éste es homozigoto para la secuencia correspondiente a la diana (BB), se obtienen tres bandas: dos de cadena sencilla correspondientes a cada una de las cadenas complementarias y una banda, localizada en la parte inferior del gel en la figura 16, que corresponde a la cadena doble no desnaturalizada. El mismo número de bandas aparecerán en un paciente homozigoto para el alelo b (ausencia de diana en homozigosis), pero en este caso y dado que cada cadena complementaria difiere de las anteriores en un nucleótido, la posición en el gel es distinta. Finalmente el heterozigoto presentará, como en los casos anteriores, una banda procedente de la cadena doble no desnaturalizada y cuatro bandas correspondientes a las cuatro cadenas sencillas.

Para finalizar comentaremos el test de proteína truncada (PTT, del inglés "protein truncation test"), como modelo de los métodos basados en el estudio de modificaciones en el producto génico.

El test PTT es un método de reciente aplicación diseñado de forma específica para detectar mutaciones que causan la aparición de un codón de paro prematuro en la molécula de ADN. Es un método técnicamente complejo, muy sensible para este tipo de mutaciones pero inaplicable para la detección de otro tipo de variaciones del ADN.

El método consiste en la amplificación mediante PCR de distintas regiones del locus a analizar, utilizando cebadores que además de contener la secuencia homóloga del fragmento a amplificar contienen en pauta de lectura, la secuencia del lugar de iniciación de la transcripción para la RNA polimerasa de T7 y un codón ATG de iniciación. Los fragmentos amplificados se utilizan como moldes en una reacción de transcripción in vitro utilizando la RNA polimerasa de T7. Así se obtienen moléculas de RNA que son simultáneamente traducidas a proteína en presencia de un aminoácido marcado. Las proteínas obtenidas son analizadas en un gel de acrilamida-SDS que permite detectar su tamaño. La aparición de proteínas con un tamaño inferior al esperado respecto a un control de secuencia normal, será indicativo de la existencia de una mutación de codón de paro prematuro en la molécula analizada.

Además de los métodos aquí descritos, existen innumerables estrategias diseñadas para la detección de nuevas mutaciones que son el fruto, en muchas ocasiones, de la capacidad imaginativa del investigador. Así mismo, numerosas casas comerciales han puesto en el mercado adaptaciones y protocolos estandarizados para la detección de mutaciones, basados en algunos de los métodos aquí comentados.


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