El diagnóstico basado en el estudio del ADN ha experimentado un avance considerable en el último decenio fruto de la identificación, caracterización y cartografiado de un elevado número de genes implicados en patologías humanas. En la actualidad, el análisis de numerosas patologías genéticas puede ser abordado en los laboratorios de genética molecular humana, tanto con una finalidad clínica como de investigación básica.

Las estrategias para el diagnóstico genético las podemos clasificar como directas o indirectas en función de si se detecta o no el gen implicado. En el primer caso podremos realizar el diagnóstico identificando en los pacientes las diferentes mutaciones del gen en cuestión. Desafortunadamente el número de enfermedades producidas por más de un tipo de mutación en un mismo o diferentes genes supera a aquellas que son consecuencia de una única mutación. Ello hace que el diagnóstico directo presente en muchas ocasiones problemas prácticos.

La segunda estrategia es independiente del conocimiento del gen implicado, pues se fundamenta en el estudio de la herencia conjunta de marcadores anónimos y el locus de la enfermedad estudiada. Para este fin, es preciso que el marcador utilizado presente un fuerte ligamento con el locus de interés, además de otras características que lo harán más o menos adecuado para el diagnóstico.

 

Introducción

El objetivo de todo proceso de diagnóstico médico es la determinación de la causa de una enfermedad. Normalmente el proceso de diagnóstico afecta a un único individuo, el paciente, y se realiza mediante unos protocolos preestablecidos y estandarizados. El diagnóstico de las enfermedades hereditarias pretende los mismos objetivos que cualquier otro proceso diagnóstico, sin embargo presenta características diferenciadoras muy significativas.

En primer lugar, el resultado de un diagnóstico genético tiene no solo efectos sobre el paciente (al que denominamos propositus) sino que todos los individuos emparentados con éste se ven afectados. Así, la unidad de estudio en el diagnóstico genético es la familia y todo proceso de diagnóstico implica un estudio familiar.

En segundo lugar, los protocolos de diagnóstico se desarrollan de forma paralela a la investigación básica y son generalmente poco estandarizados. Los laboratorios de diagnóstico genético tienen por lo general un carácter híbrido, al desarrollar actividades de investigación básica conjuntamente con la aplicación directa de la misma en el ámbito clínico. Frecuentemente el desarrollo de una nueva estrategia diagnóstica es en si misma una línea de investigación básica en la cual está implicada la caracterización de un gen y el espectro de mutaciones que causan la patología en estudio. Esta situación confiere a los laboratorios de diagnóstico genético una gran flexibilidad y adaptación a nuevas estrategias metodológicas que revierten de forma muy positiva en la calidad del servicio.

En tercer lugar, el diagnóstico genético debe dar respuesta en determinadas ocasiones a necesidades clínicas urgentes con una dimensión ético-social importante. El diagnóstico durante los períodos prenatal y neonatal requiere de una respuesta rápida y precisa. En el primer caso para dar a los padres una información completa y fiable que les permita la toma de decisiones durante las primeras semanas de gestación y en el segundo caso para poder dar una rápida respuesta terapéutica al recién nacido.

En cuarto lugar, debemos tener en cuenta que una parte importante del diagnóstico genético es probabilístico. Salvo en el caso de la detección directa de la mutación responsable de la patología, el resto de estrategias diagnósticas tienen una mayor o menor componente probabilística. Por ello, los resultados obtenidos y la "calidad" de la información facilitada al paciente y a su familia deben ser matizados en este sentido.

Finalmente, todo proceso de diagnóstico genético conlleva una precisa caracterización clínica del propositus. El diagnóstico genético tiene, en muchas ocasiones, una clara componente de diagnóstico diferencial en el que se pretende confirmar o contrastar, frente a distintas opciones, la causa de una determinada patología previamente caracterizada clínicamente. En este sentido es imprescindible la colaboración entre el personal clínico y el genetista en la elaboración del historial médico del paciente.

 

La elección de una estrategia diagnóstica

En la Tabla I se presenta de forma simplificada un cuadro dicotómico para establecer la estrategia diagnóstica más apropiada en función de las características de la patología estudiada.

Tabla I. Cuadro dicotómico para la elección de la estrategia diagnóstica

1	¿Está asociada a una alteración cromosómica ?	NO	ir a 2
		SI	Diagnóstico citogenético
2	¿Presenta herencia mendeliana?	NO	Estudios de asociación y factores de riesgo
		SI	ir a 3
3	¿Locus localizado?	NO	Diagnóstico por patrón de segregación
		SI	ir a 4
4	¿Gen identificado?	NO	Diagnóstico Indirecto con marcadores
		SI	ir a 5
5	¿Muchos alelos mutados?		Diagnóstico Indirecto con marcadores
	¿Un alelo prevalente?		Diagnóstico Directo

Un número importante de patologías genéticas están asociadas a alteraciones en el complemento cromosómico, sobre todo aquellas que se manifiestan de forma sindrómica. Si nuestra patología pertenece a este grupo la estrategia diagnóstica más adecuada será la caracterización cromosómica del propositus y de su familia. Dicha caracterización consistirá básicamente en la elaboración del cariotipo para el estudio de posibles alteraciones estructurales o numéricas.

Si nuestro caso no pertenece a este grupo, la cuestión que nos debemos plantear es si la patología presenta o no un herencia mendeliana. De tratarse de una patología con herencia multifactorial, como es el caso de numerosas enfermedades con una alta frecuencia en la población, como la hipertensión, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares etc., las únicas aproximaciones diagnósticas son los estudios de asociación y la determinación de factores de riesgo.

Si la patología estudiada presenta una herencia mendeliana definida, deberemos preguntarnos si se ha localizado o no al locus implicado. De no ser así, solo podremos ofrecer un diagnóstico basado en el patrón de segregación. Se trata en este caso de un diagnóstico eminentemente probabilístico y de una baja calidad informativa (Figura 1).

Figura 1.- Si el patrón de herencia es autosómico recesivo (AR), la existencia de un hijo afectado nos indica que los padres son heterozigotos y por lo tanto la probabilidad de que el feto esté afectado será de un 25%. Si el patrón de herencia es autosómico dominante (AD), la probabilidad de que el feto esté afectado será de un 50%. Finalmente si presenta una herencia ligada al cromosoma X (X) y el padre esta afectado, todas sus hijas serán heterozigotas (portadoras) y todos sus hijos serán normales; si la madre es portadora, sus hijas tendrán una probabilidad del 50% de ser normales o portadoras y sus hijos una probabilidad del 50% de ser normales o afectados.i el locus implicado ha sido localizado tenemos dos escenarios posibles en función de que haya sido identificado o no el gen en cuestión. Si el gen no ha sido caracterizado solo podemos realizar una estrategia de diagnóstico indirecto basada en la utilización de marcadores polimórficos próximos al locus. De nuevo se trata de una estrategia probabilística pero en este caso de una alta calidad informativa (Figura 2)

Si el gen ha sido caracterizado y se conoce la mutación o mutaciones responsables de la patología, podemos encontrarnos con dos situaciones: existe una única mutación que causa la enfermedad o su número es muy limitado siendo una de ellas muy prevalente, o bien, existe un gran número de mutaciones distintas que causan la enfermedad y su frecuencia es equitativa.

Figura 2.- El diagnóstico de la figura 1 se realiza ahora mediante la utilización de marcadores anónimos íntimamente ligados a cada uno de los loci implicados. En la primera genealogía (AR), el hijo afectado ha heredado de cada progenitor el alelo 1 del polimorfismo junto con el alelo mutante, así pues el feto que ha heredado el alelo 2 de cada padre será homozigoto para el alelo normal de la enfermedad. En la segunda genealogía (AD), el hijo afectado ha heredado de su madre el alelo de la mutación junto con el alelo 1 del polimorfismo, por lo tanto, el feto que ha heredado el alelo 2 de cada progenitor será homozigoto normal. Finalmente, en la genealogía con herencia ligada al cromosoma X, la hija es homozigota para el alelo normal de la enfermedad, dado que su hermano ha heredado de su madre el mismo alelo del polimorfismo y es fenotípicamente normal

En el primer caso, es posible abordar una estrategia de diagnóstico directo mediante la detección de la mutación única o la más prevalente. En el segundo supuesto, la existencia de un número elevado de mutaciones desaconseja un diagnóstico directo siendo mucho más apropiado un diagnóstico indirecto mediante la utilización de marcadores polimórficos.

Figura 3. El diagnóstico genético según la etapa del desarrollo y el colectivo analizado

Estas estrategias podrán ser aplicadas en la detección y caracterización de una enfermedad hereditaria en distintas etapas del desarrollo o bien a distintos colectivos de enfermos, definiéndose los distintos tipos de diagnóstico genético (Figura 3). Así por ejemplo, en función de la etapa del desarrollo del individuo analizado tendremos un diagnóstico preimplantacional, cuando se analiza el genotipo en las primeras etapas embrionarias con el objeto de detectar una determinada alteración genética, un diagnóstico prenatal cuando el genotipo es analizado durante las primeras semanas de desarrollo fetal, un diagnóstico postnatal cuando el genotipo se determina después del nacimiento, normalmente durante los primeros días después del parto (neonatal) o en períodos posteriores de la infancia o de adulto. Así mismo podemos referirnos a un diagnóstico individual, familiar o poblacional según sea el colectivo estudiado.

Análisis del patrón de segregación

La aproximación más simple que podemos hacer en el diagnóstico de una enfermedad hereditaria es el estudio de su patrón de herencia. Como hemos visto anteriormente, ésta será la única aproximación diagnóstica en muchas de las enfermedades hereditarias todavía no caracterizadas. Sin embargo no solo en este caso será preciso el estudio del patrón de herencia sino que este será una etapa imprescindible en todo diagnóstico genético, sea cual sea la estrategia utilizada.

Los patrones mendelianos clásicamente definidos no son siempre tan diáfanos y transparentes cuando se analizan en genealogías humanas. Para empezar, el número de descendientes que podemos estudiar en una familia es, por lo general, muy reducido y ello dificulta en muchas ocasiones el establecimiento de un patrón de herencia concreto. Por otra parte diversos factores pueden alterar o modificar la presentación del fenotipo en los miembros de una familia y enmascarar un determinado patrón de herencia. Discutiremos a continuación algunos de estos factores.

Variabilidad en la manifestación clínica

La manifestación clínica de una enfermedad hereditaria presenta, en la mayoría de los casos, una gran variabilidad que dificulta el establecimiento del patrón de herencia. Un carácter presenta expresividad variable cuando su manifestación clínica es heterogénea entre individuos afectados. Un ejemplo de esta situación lo tenemos en la neurofibromatosis tipo 1, cuya manifestación clínica puede ir desde manchas oscuras en la piel (manchas "cafè-au-lait") o pequeños neurofibromas cutáneos hasta enormes deformaciones óseas (el protagonista de la conocida película "The Elephant Man" del director David Lynch, es un caso extremo de neurofibromatosis). La expresividad no debe confundirse con la penetrancia del carácter. Un carácter será penetrante cuando todos los individuos portadores del alelo mutado manifiestan el carácter en uno u otro grado de expresividad. En caso contrario, cuando individuos portadores del alelo mutado no manifiestan el carácter, diremos que este es no penetrante (Figura 4).

Las razones que justifican la baja penetrancia de un carácter son en muchas ocasiones desconocidas. Puede tratarse de una caracterización clínica incompleta, o bien ser el resultado del efecto de factores ambientales o genéticos que impiden la manifestación del carácter en el individuo en cuestión. Así mismo, la penetrancia puede variar en función de la edad del individuo portador del alelo mutado. Este es el caso de las enfermedades de manifestación tardía como la poliquistosis renal del adulto o la enfermedad de Huntington.

Figura 4. Penetrancia y expresividad. En el histograma de la izquierda se representan en el eje de las ordenadas valores arbitrarios de la expresión de distintos caracteres y en las abcisas distintos individuos que presentan el alelo correspondiente al mismo. De arriba a abajo, el primer histograma se corresponde con un carácter que se manifiesta y expresa por igual en todos los individuos, es decir, un carácter penetrante con expresividad constante. El segundo histograma hace referencia a un carácter que se manifiesta en todos los individuos pero su grado de expresión es variable, es decir, un carácter penetrante con expresividad variable. En el tercer histograma se presenta un carácter que no se manifiesta en todos los individuos (en 4 de 10 no hay manifestación del carácter), pero cuando se expresa lo hace por igual en todos ellos, es decir un carácter con baja penetrancia (60%) y expresividad constante. Finalmente el cuarto histograma se refiere a un carácter que no se manifiesta en todos los individuos (en 3 de 10 no lo hace) y con un grado de expresión variable, es decir un carácter con baja penetrancia (70%) y expresividad variable. En la genealogía de la derecha se presenta una familia en la que se está heredando un carácter autosómico dominante. El fenotipo normal de los individuos "a" y "b" y la aparición del carácter en la descendencia de ambos, nos indica que se trata de un carácter con baja penetrancia.

Variabilidad en la base genética de la patología

Cuando se analiza un patrón de herencia, se suele simplificar al considerar el modelo de un gen que causa un efecto fenotípico. Desafortunadamente la situación real es mucho más compleja. En numerosas ocasiones la alteración en un determinado gen produce efectos pleiotrópicos dando lugar a alteraciones fenotípicas en distintos tejidos, órganos o sistemas. Así mismo, una determinada manifestación fenotípica presenta heterogeneidad genética cuando puede producirse por alteraciones en distintos genes (heterogeneidad de locus o génica) o distintas mutaciones de un mismo gen (heterogeneidad alélica). Ambas situaciones dificultan el establecimiento de un patrón de herencia.

Como puede verse en la genealogía de la Figura 5, la descendencia de individuos normales de dos progenitores albinos contradice el patrón de herencia recesivo. Sin embargo, la consideración de heterogeneidad génica para dicho carácter, según la cual mutaciones en homozigosis de los loci A y B pueden dar lugar a albinismo, explican esta genealogía bajo dicho patrón de herencia.

Figura 5.- La base genética de una enfermedad presenta en numerosas ocasiones heterogeneidad. En el esquema de la izquierda se indica que los loci 1 y 2 tienen efectos pleiotrópicos al dar lugar a distintas manifestaciones fenotípicas. Así mismo, el carácter "b" presenta heterogeneidad genética, pues su manifestación puede producirse tanto por alteraciones en el locus 1 como en el 2. A la derecha se presenta una genealogía en la que se hereda el carácter albinismo (autosómico recesivo). Véase en el texto para su explicación.

Variabilidad en la expresión génica

Diversos procesos epigenéticos pueden alterar la expresión de un carácter y por ello modificar el patrón de herencia observado. El modelo mendeliano asume que la manifestación fenotípica de un carácter autosómico es independiente del origen materno o paterno del alelo heredado. Dicho principio, como tantos otros, no puede generalizarse de acuerdo con la información actualmente disponible sobre la impronta del genoma. Dicho fenómeno se refiere al hecho de que en determinados genes un mismo alelo presenta una actividad génica distinta según sea heredado por la línea materna o paterna. La naturaleza molecular de la impronta es en muchos aspectos desconocida, aunque parece estar relacionada con el grado de metilación del ADN.

Otro proceso capaz de alterar la expresión génica, en este caso de genes localizados en el cromosoma X, es el fenómeno de inactivación de dicho cromosoma que se presenta en el sexo femenino.

Figura 6. Inactivación del cromosoma X. Durante las primeras etapas del desarrollo embrionario se inactivan de forma aleatoria el cromosoma X de origen materno (p+m -) o paterno (p - m+). Dicha inactivación se mantiene en todo el linaje de cada una de las células. El resultado final es un mosaico de expresión en el cual cada tejido u órgano expresará los alelos situados en el cromosoma X no inactivado.

Hombres y mujeres difieren en el número de cromosomas X. Así, el hombre presenta una sola copia de dicho cromosoma mientras que la mujer presenta dos copias. Con el objeto de compensar la dosis de expresión de los genes localizados en el cromosoma X, durante las primeras fases del desarrollo embrionario de un zigoto femenino se inactiva de forma aleatoria el cromosoma X de origen materno o de origen paterno. Dicha inactivación no comporta ningún cambio irreversible en el ADN sino que tan solo afecta a la expresión de los genes localizados en dicho cromosoma. El resultado es tal, que la mujer es un mosaico de expresión de los genes localizados en el cromosoma X (Figura 6) Una consecuencia directa del fenómeno de inactivación del cromosoma X es que una mujer heterozigota para una mutación en el cromosoma X, manifestará el alelo mutante en aquellas células en las que se haya inactivado el cromosoma con el alelo normal, independientemente de que dicho alelo sea dominante o recesivo.

Casos esporádicos

El nacimiento de un individuo afectado de una patología hereditaria en una familia en la que dicha patología no ha sido detectada previamente, genera serias dificultades en el momento de establecer el patrón de herencia.

En primer lugar, puede tratarse de un carácter recesivo y que ambos padres sean heterozigotos y por lo tanto asintomáticos, o bien, de un caso de mutación de novo producida en la línea germinal de uno de los padres que se manifiesta en el hijo afectado. Es obvio que el escenario es distinto en uno u otro caso. En la primera hipótesis se trataría de un carácter con un riesgo de recurrencia del 25%, mientras que en el segundo caso el riesgo de recurrencia dependería del número de gametos mutados presentes en el progenitor y por lo general seria mucho menor que el 25%.

La mutación de novo puede afectar a la línea germinal o a la línea somática. En el primer caso, el individuo en cuestión no manifestará la enfermedad pero transmitirá a su descendencia el alelo mutado. En el segundo caso, el individuo manifestará la enfermedad pero no la transmitirá a su descendencia. En este último caso, el grado de manifestación dependerá del número de células somáticas afectadas y del tipo de mutación.

Las mutaciones de novo o espontaneas son eventos poco frecuentes, sin embargo determinados genes presentan frecuencias de mutación significativamente altas, bien porque se trata de genes grandes que ocupan cientos de kilobases y en los cuales es más probable un evento mutacional, bien porque estén localizados en regiones hipermutables o "puntos calientes" del genoma. La incidencia de mutaciones de novo es importante en patologías con una herencia dominante como son la osteogénesis imperfecta o la acondroplasia.

 

El diagnóstico molecular

Sin duda alguna, la aplicación en genética humana de la tecnología del ADN recombinante y de los métodos de amplificación enzimática de ácidos nucleicos han supuesto una auténtica revolución metodológica. Paralelamente a este desarrollo tecnológico, el aislamiento y la caracterización de un número cada vez mayor de loci polimórficos repartidos a lo largo de todo el genoma humano ha permitido la aplicación del análisis genético en la especie humana y con ello la caracterización de un importante número de genes implicados en patologías.

Gracias a la estrecha relación entre la ciencia básica y su aplicación clínica en el ámbito de la genética humana, dichos avances han sido transferidos de forma casi instantánea de los equipos de investigación básica a los servicios de diagnóstico genético. Un claro ejemplo de ello lo tenemos en el diagnóstico de las mutaciones por tripletes inestables, en las cuales el tiempo transcurrido desde su caracterización hasta su utilización práctica puede contarse en semanas.

El diagnóstico molecular pretende la caracterización, con la mayor precisión posible, del genotipo de un individuo. Dicha caracterización la podemos realizar mediante dos aproximaciones básicas, i) el diagnóstico directo, mediante la detección del cambio producido a nivel del ADN, ii) el diagnóstico indirecto, mediante el estudio de la cosegregación del carácter estudiado y marcadores polimórficos íntimamente ligados a éste.